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王晓萌,周慧敏,董奕彤,陈胜男,安铁洙,殷萍,王春生.肌肉特异性表达 Cas9 示踪同源打靶载体的构建及其在 C2C12 细胞中的整合[J].中国实验动物学报,2022,30(3):333~342.
肌肉特异性表达 Cas9 示踪同源打靶载体的构建及其在 C2C12 细胞中的整合
Establishment of C2C12 cells with integration of a muscle-specific Cas9-tracking expression vector
投稿时间:2021-12-30  
DOI:10. 3969 / j.issn.1005-4847. 2022. 03. 005
中文关键词:  SP 启动子  肌肉特异表达  CRISPR/ Cas9  Rosa26  C2C12
英文关键词:SP promoter  muscle-specific expression  CRISPR/ Cas9  Rosa26  C2C12
基金项目:
作者单位E-mail
王晓萌 东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040 wangxiaom1027@ 163. com 
周慧敏 东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040  
董奕彤 东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040  
陈胜男 东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040  
安铁洙 东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040  
殷萍 黑龙江省医院,哈尔滨 150040  
王春生 东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040 wangchunsheng79@ nefu. edu. cn 
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中文摘要:
       目的 本研究拟构建肌肉特异表达 Cas9 示踪同源打靶载体,为成肌细胞分化研究及肌肉特异表达 Cas9 小鼠模型制作奠定基础。 方法 人工合成肌肉特异启动子 SP,替换 PX459 载体中的 CMV 启动子,构建肌肉特异表达 Cas9 载体;载体在 C2C12 细胞中的编辑效率由 XbaI 和 T7E1 酶切检测;在此基础上通过同源重组引入 DsRed 红色荧光蛋白构建 Cas9 示踪载体;将示踪载体的 SP-Cas9-DsRed 部分连接至 Rosa26 位点左右同源臂之间, 构建肌肉特异表达 Cas9 示踪重组载体;将该载体与 PX459-Rosa26 共转染至 C2C12 细胞并进行嘌呤霉素筛选,观察荧光的表达,同时,提取细胞 DNA 进行 PCR 鉴定和测序,检测载体在 C2C12 细胞中的整合情况。 结果 酶切鉴定以及对目的片段的测序结果表明,成功构建了肌肉特异表达 Cas9 载体 PX459-Rosa26-SP 和肌肉特异同源打靶示踪载体 Donor-Cas9-SP-DsRed;XbaI 和 T7E1 酶切实验表明,PX459-Rosa26-SP 在 C2C12 细胞中具有较高的编辑效 率;转染后的 C2C12 细胞出现红色荧光,表明 Donor-Cas9-SP-DsRed 具有表达活性且在肌肉细胞中特异表达;PCR 鉴定和测序结果表明,Donor-Cas9-SP-DsRed 在 C2C12 细胞 Rosa26 位点成功整合。 结论 成功构建了肌肉特异表 达 Cas9 示踪同源打靶载体 Donor-Cas9-SP-DsRed,在为肌肉特异表达 Cas9 小鼠模型制备提供载体基础的同时,也为肌肉相关基因疾病的研究与基因治疗提供了新的思路。
英文摘要:
       Objective To construct a muscle-specific Cas9-tracking expression vector to examine myoblast differentiation and establish a muscle-specific Cas9-expressing mouse model. Methods The muscle-specific promoter SP was synthesized to replace the CMV promoter in the PX459 vector. The editing efficiency of the recombinant vector in C2C12 cells was assessed by XbaI and T7E1 digestion. A DsRed fluorescent reporter protein was linked through homologous recombination to construct a muscle-specific Cas9-tracking expression vector (PX459-Rosa26-SP-DsRed). The SP-Cas9-DsRed fragment was connected between the left and right homologous arms of the Rosa26 site to construct a muscle-specific Cas9-tracking expression recombinant vector. The vector was cotransfected with PX459-Rosa26 into C2C12 cells that were selected by puromycin and fluorescence was observed. DNA was extracted for PCR and sequencing to detect integration of the vector in C2C12 cells. Results Enzyme digestion and sequencing showed that PX459-Rosa26-SP and Donor-Cas9-SP-DsRed were constructed successfully. Enzyme digestion showed that the editing efficiency of PX459- Rosa26-SP was 18. 38%. The transfected C2C12 cells emitted red fluorescence, indicating that Donor-Cas9-SP-DsRed was specifically expressed in muscle cells. PCR and sequencing showed that Donor-Cas9-SP-DsRed was successfully integrated at the Rosa26 site in C2C12 cells. Conclusions A muscle-specific Cas9-tracking expression vector was constructed successfully, which provides the basis to prepare a muscle-specific Cas9-expressing mouse model and new research ideas for gene therapy of muscle-related genetic diseases.
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