摘要: 目的 本研究拟构建肌肉特异表达 Cas9 示踪同源打靶载体,为成肌细胞分化研究及肌肉特异表达 Cas9 小鼠模型制作奠定基础。 方法 人工合成肌肉特异启动子 SP,替换 PX459 载体中的 CMV 启动子,构建肌肉特异表达 Cas9 载体;载体在 C2C12 细胞中的编辑效率由 XbaI 和 T7E1 酶切检测;在此基础上通过同源重组引入 DsRed 红色荧光蛋白构建 Cas9 示踪载体;将示踪载体的 SP-Cas9-DsRed 部分连接至 Rosa26 位点左右同源臂之间, 构建肌肉特异表达 Cas9 示踪重组载体;将该载体与 PX459-Rosa26 共转染至 C2C12 细胞并进行嘌呤霉素筛选,观察荧光的表达,同时,提取细胞 DNA 进行 PCR 鉴定和测序,检测载体在 C2C12 细胞中的整合情况。 结果 酶切鉴定以及对目的片段的测序结果表明,成功构建了肌肉特异表达 Cas9 载体 PX459-Rosa26-SP 和肌肉特异同源打靶示踪载体 Donor-Cas9-SP-DsRed;XbaI 和 T7E1 酶切实验表明,PX459-Rosa26-SP 在 C2C12 细胞中具有较高的编辑效 率;转染后的 C2C12 细胞出现红色荧光,表明 Donor-Cas9-SP-DsRed 具有表达活性且在肌肉细胞中特异表达;PCR 鉴定和测序结果表明,Donor-Cas9-SP-DsRed 在 C2C12 细胞 Rosa26 位点成功整合。 结论 成功构建了肌肉特异表 达 Cas9 示踪同源打靶载体 Donor-Cas9-SP-DsRed,在为肌肉特异表达 Cas9 小鼠模型制备提供载体基础的同时,也为肌肉相关基因疾病的研究与基因治疗提供了新的思路。