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张婷婷,杨漫漫,魏强,李燕莉,李林,王然,胡莉花,姜芳芳,刘瑜,赵卫华,李勇.CRISPR/ Cas9 介导人 HBB 基因突变体在猪成纤维细胞的靶向敲入[J].中国实验动物学报,2020,28(6):779~787.
CRISPR/ Cas9 介导人 HBB 基因突变体在猪成纤维细胞的靶向敲入
Generation of human HBB mutant knock-in porcine fibroblasts using CRISPR / Cas9-mediated homologous recombination
投稿时间:2020-05-28  
DOI:10. 3969 / j.issn.1005-4847. 2020. 06. 007
中文关键词:  地中海贫血  HBB 基因突变体  同源重组  靶向敲入  成纤维细胞
英文关键词:thalassemia  HBB mutant  homologous recombination  targeted knock-in  fibroblast
基金项目:
作者单位E-mail
张婷婷 1. 深圳华大三生园科技有限公司,广东 深圳 518000
3. 深圳市华大农业应用研究院,广东 深圳 518000 
zhangtingting100@ countrygarden.com.cn 
杨漫漫 2. 深圳动物基因组辅助育种工程实验室,广东 深圳 518000
3. 深圳市华大农业应用研究院,广东 深圳 518000 
 
魏强 2. 深圳动物基因组辅助育种工程实验室,广东 深圳 518000
3. 深圳市华大农业应用研究院,广东 深圳 518000 
 
李燕莉 1. 深圳华大三生园科技有限公司,广东 深圳 518000
2. 深圳动物基因组辅助育种工程实验室,广东 深圳 518000
3. 深圳市华大农业应用研究院,广东 深圳 518000 
 
李林 2. 深圳动物基因组辅助育种工程实验室,广东 深圳 518000
3. 深圳市华大农业应用研究院,广东 深圳 518000 
 
王然 2. 深圳动物基因组辅助育种工程实验室,广东 深圳 518000
3. 深圳市华大农业应用研究院,广东 深圳 518000 
 
胡莉花 1. 深圳华大三生园科技有限公司,广东 深圳 518000
3. 深圳市华大农业应用研究院,广东 深圳 518000 
 
姜芳芳 1. 深圳华大三生园科技有限公司,广东 深圳 518000
3. 深圳市华大农业应用研究院,广东 深圳 518000 
 
刘瑜 重庆市医药卫生学校,重庆 408000  
赵卫华 深圳市第二人民医院,深圳大学第一附属医院,广东 深圳 518028 zwhzyz123@ 163.com 
李勇 1. 深圳华大三生园科技有限公司,广东 深圳 518000
2. 深圳动物基因组辅助育种工程实验室,广东 深圳 518000
3. 深圳市华大农业应用研究院,广东 深圳 518000 
liyong3@ genomics.cn 
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中文摘要:
       目的 将人地贫相关基因 HBB(hHBB)的高频突变体基因型 Condons41 / 42(-CTTT)靶向敲入猪成纤维细胞,并筛选出基因型阳性的纯合子细胞系。 方法 (1)合成人地贫相关基因 HBB( hHBB)突变体,并构建猪 HBB 位点两条同源臂载体。 (2)利用 infusion 技术将 hHBB 突变体插入两个同源臂之间,构建同源重组终载体。 (3)用在线软件 http: / / crispr.mit.edu / 设计靶向猪 HBB 的 sgRNA,并在猪 PK15 细胞中验证其活性。 (4)利用电转染法把 CRISPR/ Cas9、sgRNA 和目的载体共同转入巴马猪胎儿成纤维细胞中,筛选单细胞克隆。 结果 (1)合成了 hHBB 突变体,从野生型巴马猪基因组上扩增左同源臂(1. 062 × 10P>3P> )以及右同源臂(1. 024 × 10P>3P> ),并将三者连接 到终载体 pGH-LA-hHBB-RA。 (2)设计合成了 11 条靶向猪 HBB 基因的 sgRNA,全部验证活性后最终挑选#2sgRNA 和#11sgRNA 用于后续实验。 (3)通过 CRISPR 系统共制备出 15 株有 hHBB 突变体定点敲入的猪成纤维细胞系,其中 6 株细胞正常表达 hHBB 基因。 结论 本研究所制备的携带人源化 HBB 基因突变体的猪成纤维细胞,将为创制高度模拟人地贫的模型猪奠定基础。
英文摘要:
       Objective The high-frequence mutant genotype Condons41 / 42 (-CTTT) of human thalassaemia- related HBB gene ( hHBB) was knocked into genome of the porcine fibroblasts by using CRISPR-Cas9 Site-specific recombination systems. Then the transfected fibroblasts were screened to establish homozygous cell lines with positive genotype. Methods (1) Synthesize the human HBB mutant with Condons41 / 42 (-CTTT) and cloned the left and right homology arm located at the flanking sequence of the pig HBB gene. (2) Then the HBB mutant was inserted between the left and right homology arm using infusion PCR method to building a final homologous recombination vector. ( 3) The sgRNA targeting pig HBB gene were designed using online software and then were verified its activity in pig PK15 cells. (4) Bama pig fetal fibroblasts were co-transfected with CRISPR/ Cas9 vector, sgRNA and pGH-LA-hHBB-RA using by electroporation and then were screened to establish single clone. Results (1) We synthesized full length of the hHBB CDS with a mutant Condons41 / 42 (-CTTT). The left and right homology arm of 1. 062 kb and 1. 024 kb were cloned from Bama pig genome. Then we constructed a final vector pGH-LA-hHBB-RA. ( 2) Two sgRNAs targeted pig HBB gene were validated in PK15 cells and used for further experiments. (3) Finally, we identified 15 single-cell clones of the porcine fibroblast carry the human HBB gene mutant. Conclusions We generated porcine fibroblast carrying the human HBB gene mutant using CRISPR/ Cas9. Our study provides key materials for scientist to generate pig models of human thalassemia.
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