摘要:目的 比较甲型流感病毒H1N1 两亚型毒株A/ Shanghai/37T/2009(H1N1)(pdm09)临床分离株和A/ Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)标准株感染C57BL/6 小鼠后,其病理状态的改变及诱生特异性CD8+ T 细胞的免疫反应?方法 ①用9. 85 × 106 半数组织细胞感染剂量(50% tissue culture infective dose,TCID50)的PR8 和pdm09病毒分别滴鼻感染野生型C57BL/6 小鼠,每日(连续14 d)观察其状态并记录死亡情况?于感染后第1?3 天处死小鼠,取其肺称重计算肺指数;左叶肺经4%多聚甲醛固定后进行H&E(hematoxylin-eosin staining)染色,观察感染后肺的病理变化;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肺病毒载量?② 用0. 25 倍半数致死量(lethal dose 50%,LD50)的PR8 和pdm09 分别滴鼻感染小鼠,每日称重连续观察?于感染后第8 天解剖取肺和脾,通过H&E 染色比较肺部病理改变;通过流式细胞术(FACS)检测脾病毒特异性CD8+ T 细胞数量比例,以及IFN-γ?TNF-α?IL-2?granzyme B 等细胞因子和免疫抑制检查点分子PD-1?LAG-3?Tim-3?CTLA-4 的表达情况?结果 ①以相同TCID50 流感病毒感染后,两组小鼠均出现疾病状态?PR8 组小鼠感染第5 天全部死亡,死亡率显著高于pdm09 组( P < 0. 01);第1?3 天肺指数和病毒载量的结果PR8 组均显著高于pdm09 组;H&E 染色结果显示PR8 组病理损伤严重,肺泡壁增厚,出现肺实质化,血细胞渗出增多,而pdm09 组小鼠肺组织病理损伤较轻,炎症浸润少;② 以相同LD50 流感病毒感染后,PR8 组小鼠的体重损失和肺组织病理损伤均比pdm09 组严重;流式结果显示PR8 组诱生的病毒特异性CD8+ T细胞比例高于pdm09 组,但是PR8 组中活化的CD8+ T 细胞(CD8+ CD44High )表达的IFN-γ?IL-2 和TNF-α 显著低于pdm09 组;检测该群细胞免疫功能耗竭分子,发现其表达了更多的免疫抑制分子PD-1 和LAG-3?结论 PR8 相对于pdm09 能够对小鼠造成更严重的损伤,可能是因为其活化的特异性的CD8+ T 细胞出现功能耗竭导致特异的免疫保护力受损,抵抗和清除病毒的能力下降,故而造成更严重的病理损伤?