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周珂,辛智倩,刘佩娟,马翠,师长宏,王华,张海.骨形态发生蛋白9 基因敲除小鼠的构建[J].中国实验动物学报,2019,27(3):311~315.
骨形态发生蛋白9 基因敲除小鼠的构建
Construction of bone morphogenetic protein 9-knockout mice
投稿时间:2018-11-01  
DOI:10. 3969 / j.issn.1005-4847. 2019. 03. 007
中文关键词:  CRISPR/ Cas9  BMP9  基因敲除小鼠
英文关键词:CRISPR/ Cas9  BMP9  gene-knockout mice
基金项目:
作者单位E-mail
周珂 1. 空军军医大学实验动物中心,西安 710032
2. 安徽医科大学药学院,合肥 230032 
472905720@ qq.com 
辛智倩 空军军医大学实验动物中心,西安 710032  
刘佩娟 空军军医大学实验动物中心,西安 710032  
马翠 1. 空军军医大学实验动物中心,西安 710032
2. 安徽医科大学药学院,合肥 230032 
 
师长宏 空军军医大学实验动物中心,西安 710032  
王华 安徽医科大学药学院,合肥 230032 wanghua@ ahmu.edu.cn 
张海 空军军医大学实验动物中心,西安 710032 hzhang@ fmmu.edu.cn 
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中文摘要:
      目的 运用CRISR/ Cas9 技术敲除小鼠基因组中Bmp9 基因片段,构建Bmp9 基因敲除小鼠?方法 根据Bmp9基因的外显子序列,设计一段sgRNA 并合成?sgRNA 体外转录后和Cas9 mRNA 混合后显微注射受精卵细胞,注射后的受精卵细胞移植至受体动物获得子代小鼠?提取子代小鼠基因组DNA 测序鉴定其基因型?基因型鉴定正确的小鼠与野生型交配后筛选纯合子小鼠?同时取纯合子小鼠心脏?肝?脾?肺?肾,匀浆后提取总RNA和总蛋白,通过qPCR?WB 和免疫组化检测BMP9 在各组织中的表达?结果 设计并合成20 bp 的sgRNA 并进行体外转录,显微注射并回植后得到基因突变小鼠,连续交配后得F2 代纯合子?测序结果显示,突变小鼠存在两种基因型,一种为5 bp 缺失突变,另一种为13 bp 缺失并伴有1 bp 插入突变?与野生型C57BL/6 相比,qPCR?WB 和免疫组化结果均表明基因敲除小鼠肝中BMP9 表达显著降低?结论 利用CRISPR/ Cas9 技术成功构建出了BMP9基因敲除小鼠?
英文摘要:
      Objective To construct bone morphogenetic protein 9 (Bmp9)-knockout mice using CRISPR/ Cas9technology. Methods sgRNA were designed and synthesized according to the Bmp9 sequence in Genbank. After in vitrotranscription of Bmp9 sgRNA, a Cas9 and sgRNA mixture was microinjected into zygotes of C57BL/6 mice, which werethen transplanted into ICR mice. The offspring mice were identified with Sanger sequencing and mutant mice were matedwith wild-type mice to screen for mice harboring a homozygous mutation. Meanwhile, qPCR, western blot, andimmunohistochemistry were used to detect the expression of BMP9 in the heart, liver, spleen, lung, and kidney. Results A 20-bp sgRNA was synthesized and transcribed into RNA. After microinjection, transplantation, and mating, homozygousF2-generation mice were obtained. The results of sequencing revealed two genotypes: one with a 5-bp deletion and anotherwith a 13-bp deletion and 1-bp insertion. Compared with the wild-type C57BL/6 mice, results of qPCR, western blot, andimmunohistochemistry showed a marked decrease in BMP9 in the liver of Bmp9-knockout mice. Conclusions Bmp9-knockout mice are successfully generated using CRISPR/ Cas9 technology.
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